Расшифровка количественного анализа на вирус гепатита С

Спустя 10 лет после изобретения, метод молекулярной биологии, названный полимеразной цепной реакцией, нашел широкое применение в медицине и биологии. ПЦР. Он основан на амплификации и других манипуляциях с фрагментами ДНК. Метод позволяет определить и вирус гепатита С: количественный анализ, расшифровка которого требует определенных знаний и практического опыта, дает очень ценные данные о гепатотропном генотипе и его состоянии.

Проведение аппаратного исследования осуществляется в специальном приборе – амплификаторе, посредством реакции, проходящей три стадии, в каждой из которых несколько циклов. За это революционное открытие американский биохимик Муллис был удостоен Нобелевской премии.

Методы лабораторной диагностики

Обычно определение присутствия гепатита С в организме – многоступенчатая и сложная цепочка исследований, что легко объясняется спецификой патогенного агента. Достойный представитель семейства флавивирусов присутствует в организме в виде квазиштаммов. Они образуются уже в человеческом организме и трудно поддаются идентификации из-за многообразия серотипов и подтипов, уже существующих или мутирующих при длительной персистенции.

Еще недавно, каких-то два десятилетия назад, его называли гепатит «ни А, ни В», потому что симптоматика напоминала известные виды, но и отличалась от них по многим признакам. И только относительно недавно удалось наконец выделить HCV (Hepatitis C Virus) – в 90-х годах, благодаря созданию специфического теста.

Между тем инфицированность представителями одного из видов флавивирусов – гепацивирусами, достигла катастрофических пределов. Численность инфицированных достигла значительных пределов и превратилась в социально значимую проблему для всей мировой медицинской общественности. Своевременная расшифровка позволяет не только увеличить шансы на выздоровление, но и уменьшить вероятность распространения инфекции.

Основным ее источником по-прежнему остается зараженный человек. Он представляет собой резервуар для хранения вирионов, увеличивающихся ежеминутно и выделяющихся со всеми биологическими жидкостями. Гепатитом С можно заразиться через сперму и слюну, кровь и слизь.

Диагностические стандарты

При подозрении на острую форму протекания вируса (ОГС) применяются обязательные и дополнительные лабораторные анализы. При ХГС (хронический гепатит, вирус С) протокол меняется незначительно, дифференциальная диагностика проводится по таблице маркеров. Обязательные (общий анализ крови, ОАМ, биохимия, коагулограмма и иммунология для выявления антител к ВГС и HBsAg), дают определенные данные, но недостаточно они информативны.

Даже если общие антитела к Hepatitis C Virus обнаружены, расшифровка только говорит о наличии контакта с ним, но абсолютно ничего не сообщает о давности процесса, его развитии или угасании.

И это только основание для дополнительных обследований, которые могут подтвердить или опровергнуть присутствие вируса. По устоявшейся традиции основные продолжают называть дополнительными или специфическими, хотя на самом деле их расшифровка уже довольно давно стала играть превалирующую роль в определении вирусного присутствия в выстраивании терапевтической тактики.

Диагностические дифференциации по использованным принципам

Специфическая диагностика развивалась на протяжении нескольких десятилетий. Только в иммуноферментной диагностике последовательно существовало 4 поколения тестов, но уже расшифровка третьего была достаточно информативным и чувствительным, а разрабатываемые ныне уже позволяют выявить самое минимальное количество в миллиграмме крови.

Современные способы определения присутствия инфекции работают по двум принципам:

1. Серологические основаны на определении антител, но при специфике HCV они недостаточно объективны. Весь процесс заболевания основан не столько на поражении клеток печени, сколько на подрыве иммунной системы. Именно поэтому некомпетентные люди часто путают ВИЧ и гепатит С. Этот вид гепатотропного поражения состоит из двух основных моментов: пока организм разрабатывает антитела к однонитчатой РНК, она успевает видоизмениться, и мутировать, образовать квазиштаммы. Пока на новообразованную разновидность образовываются антитела, они уже устаревают. Поэтому обнаружение антител может свидетельствовать не о конкретной разновидности, действующей в настоящий момент, а о той, с которой контакт состоялся ранее. Таким образом определить расшифровкой корректную тактику борьбы маловероятно.
2. Молекулярно-биологические способы не случайно получили статус великого открытия. Обнаружение РНК вируса позволяет увидеть противника в том варианте, в котором он присутствует в момент проведения анализа. Применение качественных и количественных критериев со временем поменялось. Если ранее качественный был чувствительнее своего оппонента, то теперь он практически отодвинут на второй план. Таким востребованным количественный анализ на гепатит С стал после появления новейших разработок. С их помощью можно получить и представление о вирусной нагрузке и сделать прогноз о течении заболевания и осуществлять мониторинг проведения.

Виды исследований и их недостатки

Появление молекулярно-биологических методов избавило гепатолога от необходимости назначать несколько видов лабораторных исследований и собирать из каждого из них необходимые крупицы информации. Только появление новых способов обнаружения РНК позволило поставить расшифровку данных на достоверный уровень. Ранее все обстояло более сложным образом:

1. Из серологического получали данные об уровне антител, на тот момент только позволяющие увидеть присутствие вируса, без разъяснений, почему он появился.
2. Проведение теста на иммуноглобулины возможно только после их появления, но это – иммунный ответ, который к моменту своего появления успел устареть и стал непродуктивным из-за трансформаций вирусного РНК.
3. Экспресс-анализ любой категории всегда недостоверен, именно потому, что это – быстрый тест, не позволяющий как следует проанализировать существующее положение. И его всегда нужно проверять неоднократно, причем, не повторением уже проделанного, а кардинально другими методами. То, что говорят об экспресс-тестах и их расшифровке изготовители рекламы, на самом деле редко соответствует реальному положению дел.
4. Гепатолог мог ориентироваться на биопсию, эластометрию и аппаратные методы исследования, но для их назначения, особенно если они инвазивны, как биопсия, нужны веские основания и определенная стадия болезни.
5. Отходящий на второй план качественный метод тоже давал всего два результата – присутствие вируса в исследуемом биоматериале или его отсутствие.

Оба ответа можно было трактовать неоднозначно. Если HCV не обнаружен, то его и в самом деле нет, или он в такой ничтожной концентрации, что пока не поддается отслеживанию.

Если присутствие подтвердилось – то это всего лишь констатация имевшего место инфицирования. Но неизвестно, первичное ли это инфицирование, прогрессирование заболевания или остаточные явления, сохранившиеся после самоисцеления организма. У количественного анализа на гепатит гораздо больше информации и способов применения полученных данных.

Количественный анализ – суть метода и его место среди других исследований ПЦР

Полимеразная цепная реакция – метод диагностики Hepatitis C Virus, с помощью которого проводится целых три анализа, способных обеспечить верификацию диагноза, находящегося на стадии предположения. Достоверность качественного анализа нередко ставится под сомнение, поскольку для исследования должна применяться высокочувствительная система тестирования.

Несовершенство качественного метода заключается еще и в том, что после него нужно непременно заниматься другими обследованиями. В нынешнем виде выполнение качественного исследования нуждается в перепроверке, и даже отрицательный ответ на присутствие вируса тоже не может быть окончательным.

Количественный метод более известен, как вирусная нагрузка. Как и должно быть при таком названии, результат и выводы основаны на подсчетах – сколько единиц инфекционной однониточной цепочки РНК находится в 1 мл биологического материала. Золотым стандартом такого метода считается транскрипционная амплификация или ТМА.

Пока такое исследование можно пройти только в ультрасовременных медицинских центрах, у которых есть средства на приобретение дорогой аппаратуры. ТМА считается новейшей разработкой, еще не доведенной до логического завершения. Но несомненно, что это она уже не четвертого, а пятого поколения, и будет использоваться в самом скором времени.

Генотипирование позволяет определить генотип гепатита С. Их официально признано 6, и каждый из них встречается на определенной территории. Это исследование необходимо для определения лечебной тактики. Поскольку для каждого генотипа предполагается разная длительность медикаментозной терапии и прогноз по обнаруженному типу, хотя иногда возможен ответ и о нетипировании возбудителя.

Цели и задачи количественного исследования

Иногда количественный метод полностью отождествляют с определением вирусной нагрузки. Однако с помощью полимеразной цепной реакции решается не только необходимость подсчета содержания ПНК возбудителя в крови инфицированного человека. Диагностика на достоверном уровне – основная цель проводимого исследования. Но спектр полученной информации не ограничивается цифрами.

Для этого можно использовать и метод разветвленной ДНК, правда, с меньшей степенью достоверности, и тест на иммуноглобулины, недостаток которого заключается в необходимости тратить время на ожидание иммунного ответа организма.

А это в любом случае означает, что упускается драгоценное время для лечения. Задачи проведения количественного метода более многочисленны:

• диагностика заражения гепатитом еще в той стадии, когда остальные методы не могут этого сделать;
• определение самоизлечения (в иных случаях присутствие выработанных антител может ввести в заблуждение и дать уверенность в присутствии активного вируса);
• уровень нагрузки дает развернутое представление о степени геномной агрессивности;
• наглядная демонстрация степени успешности проводимой терапии;
• выявление компонентов, которые свидетельствуют о степени деструкции пораженного органа.

Стандартно выявляемый уровень вирусной нагрузки при диагностике ПЦР 50 МЕ (международных условных единиц, соответствующих наличию 125 копий в одном мг крови). Если сравнивать с транскрипционной амплификацией, это может показаться довольно низкой чувствительностью, потому что ТМА видит 10 МЕ или 25 копий в одном миллиграмме. Однако если обратиться к более дешевому методу разветвленной ДНК, то его способность видения всего-навсего 1250 копий или 500 МЕ, ровно в 10 раз ниже.

При этом последний не решает ни одной из задач, ради которых и используется более дорогой метод ПЦР. В определении подходящего метода и его расшифровке стоит ориентироваться не на стоимость теста, а на его эффективность. Это дает возможность обнаружить возбудитель на самом раннем этапе инфицирования, пока его количество в крови составляет ничтожную концентрацию.

Многое зависит от ресурсов, которыми располагает лаборатория или медицинский центр. Ведь амплификатор (прибор для проведения ПЦР) может быть разных модификаций, как и набор комплементарных праймеров, ДНК и полимераз. В вирусологии часто декларируется принцип, что возбудитель может не обнаружиться не потому что его нет, а потому что нет достаточных ресурсов для его идентификации.

Расшифровка полученных данных

В отличие от качественного метода, ПЦР для получения цифровых измерений всегда предполагает вариабельность толкования, даже несмотря на приведенные точные цифры. Всемирная организация здравоохранения считает, что окончательный диагноз можно ставить только после сравнения трех полученных результатов, и у такой диагностической триады есть даже собственное название – тест 321.

Попытка самостоятельной расшифровки для пациента – абсолютно бесполезное занятие, потому что для получения полной картины гепатолог использует не только лабораторную и аппаратную диагностику, но и физикальные результаты, анамнез, описанные симптомы и визуальные признаки. Ложноположительный анализ могут давать эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на организм.

Есть целый ряд заболеваний, способных ввести в заблуждение чувствительную тест-систему. И точно так же есть подтипы гепатита, на которые может не отреагировать амплификатор без необходимых комплементарных праймеров, ЛНК и полимераз. Ведь на сегодняшний день уже известно более 90 подтипов вируса гепатита С.

Есть условная граница, от которой производятся необходимые расчеты. Отсутствие каких-либо признаков присутствия патогенного агента считается нормой для здорового человека. По мнению экспертов ВОЗ, любой полученный результат нуждается в перепроверке, неважно, получен отрицательный или подтверждающий итог.

Эксперты ВОЗ не случайно пришли к мнению о необходимости троекратного проведения количественного анализа. Существует множество факторов, способных повлиять на точность проводимого исследования – от ингибиторов и гепарина в крови до элементарных погрешностей в приготовлении исследуемого образца. Задача каждого последующего анализа – исключить факторы, способные повлиять на результат.

Статьи по теме

Диагностика вирусной РНК гепатита С

читать

Вирус гепатита B: отличия заболевания и его опасность

читать

Анализ на гепатит С: ПЦР-диагностика

читать